Agrisera：Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗体

文章解析：《Proximity-dependent mapping of the HCMV US28 interactome identifies RhoGEF signaling as a requirement for efficient viral reactivation》

链接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1011682

人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）是β-疱疹病毒家族中最大的成员，全球大多数人口均受其感染。HCMV感染通常在初次感染后表现为无症状，并能在髓系细胞中建立终身潜伏感染。在潜伏期间，病毒会持续存在于宿主体内，主要在骨髓中的造血祖细胞（Hematopoietic Progenitor Cells，HPCs）内。由这些HPCs生成的潜伏感染单核细胞被认为是病毒传播到身体其他组织的主要细胞库。对于免疫功能低下的人群，如移植受者和艾滋病患者，病毒的再激活事件可能引发危及生命的健康并发症，包括器官衰竭和移植物排斥。

尽管已经发现多个细胞信号通路与HCMV的潜伏和再激活有关，如EGFR、PI3K/AKT、MAPK、TGF-β、Src、ERK、Rho和Wnt通路，但参与建立潜伏和再激活潜能的确切信号机制仍不清楚。此外，目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的HCMV抗病毒药物往往具有毒性作用，且主要针对病毒复制晚期，即临床症状已经出现时。因此，为了发现HCMV的额外治疗选项，阐明介导病毒潜伏和再激活的分子机制至关重要。

HCMV编码四种推定的G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs），它们与细胞趋化因子受体具有同源性，其中US28是迄今为止研究最深入的。US28在潜伏期和再激活期间均在感染的人外周血细胞中表达，并参与细胞增殖、分化和迁移等多种生物学过程的调控。尽管已知US28对于HCMV的潜伏/再激活至关重要，但参与这些过程的具体细胞信号通路尚未完全明确。

方法

为了深入探究US28在HCMV潜伏和再激活中的信号传导机制，本研究采用了邻近依赖的生物素化酶（TurboID）技术来表征US28在孤立表达、潜伏感染（CD34+ HPCs）和裂解感染（成纤维细胞）期间的相互作用网络（interactome）。TurboID技术是一种基于生物素连接酶BirA的邻近标记方法，它能够在空间上接近目标蛋白的蛋白质上共价添加生物素标签，从而允许通过质谱分析来识别这些相互作用蛋白。

实验中使用的关键试剂：

Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗体（货号：AS20 4440，Agrisera品牌）：该抗体专门用于检测和验证TurboID融合蛋白的表达和活性。在实验中，它用于确认TurboID标签已成功融合到US28蛋白上，并确保邻近依赖的生物素化反应能够正常进行。这一步骤对于后续通过质谱分析准确识别US28的相互作用蛋白至关重要。

实验

构建TurboID-US28融合表达载体：首先，研究人员构建了表达TurboID-US28融合蛋白的载体，并将其转染到目标细胞中。

邻近依赖的生物素化：在TurboID-US28融合蛋白表达后，细胞被处理以允许TurboID酶催化邻近蛋白的生物素化。这一步骤使得与US28空间上接近的蛋白质被标记上生物素。

质谱分析：接下来，利用质谱技术对生物素化的蛋白质进行鉴定，从而揭示US28的相互作用网络。

功能验证：通过免疫印迹（immunoblot）和小分子抑制剂实验，对质谱分析鉴定出的关键相

互作用蛋白进行功能验证。特别地，本研究关注了RhoGEFs（Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors）作为US28信号转导的重要中介体。体外和体内再激活实验：利用原代CD34+ HPCs和人源化小鼠模型，研究人员评估了RhoGEF抑制剂（如Rhosin和Y16）对HCMV再激活的影响。

结果与结论

本研究通过邻近依赖的TurboID技术，成功绘制了US28在孤立表达、潜伏感染和裂解感染期间的相互作用网络。质谱分析显示，US28信号复合体与RhoA和EGFR信号转导通路存在显著重叠，共享多个在细胞增殖和分化等过程中起主要作用的介质。特别地，研究发现了RhoGEFs作为US28信号转导的关键中介体。RhoGEFs是RhoGTP酶的激活剂，它们直接连接细胞表面受体（如US28）和RhoA的激活，从而调控细胞迁移、分化等生物学过程。通过功能验证实验，研究人员证实了RhoGEFs在US28信号转导中的重要作用。

进一步地，在体外和体内再激活实验中，使用RhoGEF抑制剂（Rhosin和Y16）处理原代CD34+ HPCs和人源化小鼠模型，结果显示这些抑制剂显著抑制了HCMV的再激活。这一发现不仅验证了RhoGEFs在US28介导的病毒再激活中的关键作用，也为开发针对HCMV的新型抗病毒药物提供了潜在的靶点。

Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗体的作用和价值：

在本研究中，Agrisera品牌的Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗体（货号：AS20 4440）发挥了至关重要的作用。首先，该抗体确保了TurboID-US28融合蛋白的成功表达和正确融合，这是整个实验的基础。通过特异性地识别TurboID标签，该抗体允许研究人员在细胞水平上验证融合蛋白的存在和活性，从而确保了后续邻近依赖的生物素化反应的有效性和准确性。

其次，该抗体的使用提高了实验的特异性和灵敏度。在复杂的细胞环境中，确保TurboID标签的特异性识别对于减少背景噪音和假阳性结果至关重要。Agrisera的Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗体以其高特异性和亲和力，为研究人员提供了可靠的工具来检测和验证TurboID融合蛋白的表达，从而确保了实验结果的准确性和可靠性。

最后，该抗体的应用为后续的功能验证实验奠定了基础。在确认TurboID-US28融合蛋白成功表达后，研究人员能够利用质谱技术鉴定出与US28相互作用的蛋白质，并通过免疫印迹等实验方法进一步验证这些相互作用。这一过程不仅揭示了US28的相互作用网络，也为理解HCMV潜伏和再激活的分子机制提供了宝贵的线索。

综上所述，Agrisera品牌的Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗体（货号：AS20 4440）在本研究中发挥了不可替代的作用，它不仅确保了实验的成功进行，还为揭示HCMV潜伏和再激活的分子机制提供了有力的技术支持。这一发现不仅加深了我们对HCMV生物学特性的理解，也为开发针对该病毒的新型抗病毒药物提供了潜在的靶点和治疗策略。